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——色谱与质谱联合分析
摘要：本文研究了葡果酒中芳香成份的分析方法。鉴于葡果酒中芳香成份含量甚微，而且酒中存在大量糖类、不挥发酸、氨基酸、维生素、矿物质等，不能采用直接进样的气相色谱分析方法。本文提出了用二氯甲烷萃取并浓缩五百倍的方法，并进行酸分离，从而使微量芳香成份得以分离鉴定：用标准纯物质进行色谱法对比和色谱——质谱联合分析两种方法配合，共鉴定出葡果酒中主要的芳香组分，包括醇、酯、酸、内酯、酚类、含硫醇类等64种香味化合物。并分别进行了初步定量。用此法剖析了六种不同类型的葡果酒，证明提出的方法实用简便，可在葡果酒研究和生产管理上推广使用。
一、关于气相色谱与质谱联合分析法
葡果酒的芳香成份种类复杂，而且各组分彼此浓度差别大，极性和沸点相差也大，加之葡果酒属非蒸馏酒，其中又含有较大量的糖类、不挥发酸、氨基酸、维生素、矿物质、色素单宁等不挥发性物质。这就使葡果酒中芳香成份的分析工作更增加了复杂性和艰难性。由于葡果酒的香味组成与其产品质量有着密切的关系，它的剖析工作始终是葡果酒研究中的一个急需研究的课题。
目前国内在葡果酒研究和生产质量管理方面一般仅测定乙醇、总糖、总酸、挥发酸、二氧化硫、铁、总酚等有限的几个常规项目。用一般的理化手段是不可能达到对气味混合物全分析的目的。由于难度大，技术要求高，至今还没有人系统研究过。七十年代毛细管色谱技术的发展以及程序升温和带微机处理机的气相色谱仪的应用。对食品中香味的定性和定量快速分析可以说是一大突破。近年来应用毛细管气相色谱与质谱的联合分析，以及进一步与数据系统（计算机检索与质谱数据库）串联在一起，又把香味成分分析进一步提到了一个更加迅速、准确的新水平。近年来利用这些新技术国外在葡果酒的剖析方面已做了不少工作，取得了一些成果。
因为葡果酒中大量不挥发物的干扰，会使毛细管色谱柱遭到污染。因而不能采用白酒的直接进样法。此外葡果酒中的香味化合物的含量比白酒少得多，一般要低十倍或百倍以上。用填充柱的直接进样法，只能测出个别含量大于10ppm的组分（如正丙醇、异丁醇、异戊醇、乳酸乙酯、β—苯乙醇等），所以为了进行葡果酒的芳香成分分析，必须进行这些组分的予分离和浓缩等步骤。
予分离选用二氯甲烷为萃取剂，因它对大部分香味组分有着良好的溶解度。萃取浓缩物的气味与原酒风味很相似。另一方面二氯甲烷对果酒中含量最大的水和乙醇的溶解度都很小，能防止大量乙醇存在影响其它组分的检测。经过重复萃取后，所得萃取液再进行浓缩。只有经过浓缩五百倍后，果酒中的有些微量成分才能在毛细管色谱图中检测到。
由于萃取浓缩液中含有较多的挥发性有机酸（如乙酸、异丁酸、异戊酸、己酸等）。这些酸峰中常包含有一些微量的香味组分。为了检出这些组分，我们又将萃取浓缩液用3%碳酸钠溶液进行酸分离。然后将脱酸的中性部分和酸的部分分别用毛细管色谱进行分离鉴定。
未知化合物的判定，我们应用了色谱法和色谱质谱联合定两种方法。一般性成分用标准试剂在同样的色谱条件下测定其保留时间的方法来判定。但有些组分由于缺少标准物质核对，须进一步在色谱质谱联用仪器上来鉴定。我们重点地对解百纳干红葡萄酒用上述二种方法进行了剖析，共鉴定出其中的香味化合物包括醇、酯、酸、内酯、酚类、含硫醇等64种。我们还选用了六种不同类型的葡果酒（葡萄酒、越橘酒、红豆酒、沙棘酒等）按所拟定的方法进行了剖析和初步的定量。实验证明，这些方法实用有效。可以在葡果酒的研究和质量控制上推广应用。
二、实验方法
1.果酒样品的予处理
（1）萃取浓缩液
取葡果酒样品300毫升置于分液漏斗中，加入150毫升二氯甲烷萃取剂，摇均匀，静置分层后，将下层萃取液分出在另一分液漏斗中，向上层酒液再加150毫升二氯甲烷进行再次萃取。两次萃取液合并，取1/3萃取液加无水硫酸钾干燥过夜。用KD浓缩器在低于40℃下浓缩为0.2毫升，供气相色谱分析用。
（2）中型浓缩液
取上述另外2/3萃取液在KD浓缩器中浓缩至25毫升左右，移入分液漏斗。加入25毫升3%碳酸钠液再萃取一次。碳酸钠液合并后，用少许二氯甲烷洗涤，洗涤液并入二氯甲烷萃取液。然后加无水硫酸钠脱水干燥，放置过夜。最后将萃取液用KD浓缩器在40℃以下浓缩至0.4毫升，此为脱酸后的中性部分。
（3）酸性浓缩液
上述碳酸钠溶液用1:1盐酸调PH值至1.5，然后用40毫升二氯甲烷萃取。重复萃取一次。合并萃取液，加无水硫酸钠干燥后，在KD浓缩器中浓缩至0.4毫升。此为酸性组分。
以上三种浓缩液均分别注入毛细管色谱柱进行色谱分析。
2.毛细管气相色谱分析
（1）分析仪器
日本岛津GC—5A气相色谱仪
毛细管柱架CLR—1型
数据处理器CR1—B型
石英毛细管色谱柱：30；米长，内径0.25毫米，内涂FFAP（键合型），兰州化物所制。
（2）分析条件
①温度
色谱柱起始温度50℃，保持5分钟后，以4℃/分升温至180℃，然后恒温至全部组分出完，总时间为80分钟。
汽化室温度：230℃。
鉴定器 温度：230℃。
②气体流速
载气（氮气）流速：30毫升/分
分流比：1:50
毛细管线速度：13.3厘米/秒
氢气流速：50毫升/分
空气流速：1000毫升/分
③氢火焰鉴定器灵敏度：103×2
④记录纸速：4毫米/分
⑤样品注入量：2毫升
3.色谱——质谱联合分析
（1）仪器
美国惠普公司5890型气相色谱仪与5988质谱仪联合使用。
色谱柱石英弹性毛细管：PEG20M（未键合），25米长，0.2毫米内径，液膜厚度0.20微米。
（2）分析条件
①色谱柱温度：起始温度60℃，保持5分钟后以40℃/分升温至200℃，保持20分钟。
②载气（氮气）分流比：1:22，毛细管线速度0.51厘米/秒。
③质谱离子源180℃，电子能量70E?V，真空度1.7×10－6。
④进样量：2微升。
三、实验结果
用色谱法（标准纯物质核对各峰的保留时间）和色谱——质谱联合分析共鉴定出主要的香味化合物共64种。其中醇类23中，酯类22种，酸类9种，内酯3种，酚类2种，羟基化合物3种。
六种葡果酒中香味化合物的初步定量结果
解百纳干红葡萄酒（烟台） 雷司令干白葡萄酒（烟台） 干红葡萄酒原液（托克托县） 越橘酒原液
（牙克石） 红豆酒原液
（牙克石） 沙棘酒原液
（乃林）
酒度（20℃） 10.3 10.5 17.4 13.4 12.3 16.2
总酸（酒石酸计克/升） 6.66 7.01 7.75 14.09 13.19 12.61
挥发酸（乙酸计克/升）计克/升） 0.358 0.218 0.135 0.461 0.377 0.174
醇类
甲醇** 47.14 未测 66.03 75.62 43.51 94.49
正丙醇** 7.78 8.38 14.38 5.30 12.60 8.32
仲丁醇 0.14 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05 66.50 0.21
异丁醇** 60.63 42.07 87.35 44.54 15.81 13.14
正丁醇 1.52 0.52 ＜0.05 0.39 10.90 0.23
异戊醇** 173.1 210.5 190.3 109.4 63.15 27.90
正戊醇 0.12 0.11 0.13 ＜0.05 ＜0.05 0.60
正己醇 0.60 1.82 7.65 1.19 0.68 0.60
2—庚醇 ＜0.05 0.23 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.30
正庚醇 0.20 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.55
壬醇—5 0.21 0.09 0.34 2.18 — 0.61
正辛醇 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 — —
正癸醇 1.42 1.17 0.12 — ＜0.01 2.39
顺—3—巳烯醇 0.08 0.24 ＜0.01 0.97 0.12 ＜0.05
反—3—巳烯醇 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.01 — 1.06 ＜0.01
3—乙氧基丙醇 0.11 0.25 0.20 1.57 0.20 0.51
3—甲基—2—巳醇（包括部分未知酸） 0.46 ＜0.01 0.61 2.19 0.21 5.80
2，3—丁二醇 0.26 ＜0.05 0.48 1.25 ＜0.01 1.79
3—甲硫基丙醇 1.28 0.84 0.23 ＜0.01 0.12 6.80
苯甲醇 1.53 0.44 1.02 0.78 13.21 3.22
β—苯乙醇 26.13 35.81 21.29 20.32 16.06 9.35
十二醇 ＜0.05 ＜0.05 — — ＜0.05 ＜0.05
酯类
乙酸乙酯** 131.4 54.24 81.70 300.6 267.6 82.0
丙酸乙酯* 0.60 0.52 0.53 1.26 0.73 未测
异丁酸乙酯* 0.45 1.33 0.72 1.60 1.36 未测
丁酸乙酯* 0.34 0.53 0.69 0.91 0.44 未测
乙酸丁酯* 0.28 0.10 0.69 0.06 — 未测
异戊酸乙酯* 0.06 0.05 — 0.38 1.04 未测
乙酸异戊酯* 0.34 1.00 1.33 0.13 0.34 0.32
己酸甲酯 ＜0.05 0.08 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.05 ＜0.01
己酸乙酯* 0.36 0.64 0.64 0.23 0.10 20.17
乙酸己酯 0.07 0.66 0.20 ＜0.05 ＜0.05 0.30
庚酸乙酯 0.27 0.25 0.15 — ＜0.01 0.18
乳酸乙酯** 342.2 43.50 202.7 7.9 5.9 4.6
辛酸乙酯* 0.68 1.06 1.60 0.24 0.27 0.24
癸酸乙酯* 0.14 0.18 0.14 0.04 0.05 ＜0.05
十二酸乙酯 ＜0.05 — 0.81 0.31 ＜0.01 ＜0.05
十四酸乙酯 ＜0.05 0.06 1.52 ＜0.01 0.31 ＜0.05
十八酸乙酯 0.23 0.15 0.17 6.23 — —
3—羟基丁酸乙酯 0.20 0.40 0.68 0.69 0.61 1.39
丁二酸二甲酯 ＜0.05 — 0.69 ＜0.01 ＜0.01 0.26
丁二酸二乙酯 9.09 2.59 4.14 19.32 2.62 1.34
β—乙酸苯乙酯 ＜0.05 0.58 ＜0.05 1.47 ＜0.01 ＜0.05
酸类
乙酸 114.5 88.15 76.25 132.22 未测 73.34
丙酸 40.35 52.46 36.97 3.59 8.78 0.36
异丁酸 7.35 6.96 5.33 1.04 2.17 5.53
正丁酸 0.95 2.80 1.12 0.69 0.76 3.67
异戊酸 2.84 5.32 1.01 1.22 5.82 1.55
己酸 5.07 8.11 3.36 1.54 0.44 55.81
辛酸 8.18 15.22 17.13 — 1.22 2.75
癸酸 10.25 5.33 5.07 0.95 1.30 2.76
丁二酸——乙酯 90.54 56.91 49.66 128.92 38.27 26.68
羟基化合物
乙醛** 8.01 3.89 2.40 2.62 3.09 14.70
醋嗡 3.61 0.40 4.38 0.32 0.98 2.36
糠醛 1.04 ＜0.05 2.60 2.16 ＜0.01 0.97
芳香烃
萘 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01 ＜0.05 18.14 0.20
1—甲基萘 0.30 0.45 0.12 ＜0.01 0.90 ＜0.05
酚类
4—乙基鱼创木酚 0.19 0.42 ＜0.01 — 0.69 ＜0.05
4—乙基苯酚 1.54 ＜0.01 ＜0.01 2.62 2.29 —
内酯
r—丁内酯 24.16 4.13 8.28 6.80 4.98 2.26
乙酰基丁内酯 1.36 3.00 3.11 29.81 6.23 1.64
乙氧甲酰基丁内酯（包括少量十六酸乙酯） 5.97 3.80 6.58 3.35 1.24 1.98
注：
①表中“—”符号为未检出。
②表中“*”符号的化合物含量为动态顶空法测得。
③表中“**”符号的化合物含量为DNP混合填充柱上直接进样法测得。
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